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慢頻下不同針刺時間影響內關穴干預MCAO大鼠效應的實驗研究

作者:孫夢曉 來源:本站原創 點擊:735次 更新:2018-12-19
  

山东福彩七乐彩走势图 www.fybdgj.com.cn 楊 沙134,樊小農135,羅 丁2,張亞男2,魏媛媛2,張海濤2,陳建飛2,賀妮娜2,常曉波2,王 舒134,孟智宏1,石學敏1

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所,2.天津中醫藥大學,3.國家中醫藥管理局腦病針刺療法重點研究室,4.天津市針灸學重點實驗室,5.國家中醫藥管理局量效關系三級實驗室,天津 300193)

[摘  要] 目的:探討慢頻率下,不同針刺時間參數對內關穴經穴特異性的影響。方法:參照Zea-Longa線拴法復制大腦中動脈缺血模型(MCAO),隨機分為基礎組即正常組、假手術組、模型組、非針刺組以及內關短時間組(5秒)、中時間組(60秒)和長時間組(180秒)共七組,內關穴三組針刺參數是固定1次/秒頻率分別應用5、60、180秒的針刺時間,并每12小時針刺一次持續6次。觀察效應指標即動物神經功能情況、缺血局部微循環血流量、腦組織梗死率,和機理指標包括微循環血管輸入枝、輸出枝管徑,以及腦組織HE染色的細胞形態學指標。模型組在造模成功即刻,后四組在造模后72小時觀察指標。結果:內關三個組在效應指標的改善上優于模型組、非針刺組(P<0.05),機理指標中,內關皮層、海馬、紋狀體的微血管數、正常神經細胞數(P<0.05)增加,對各項指標的改善,以中長時間較優。結論:針刺內關穴可獲得較好效應,針刺時間可影響經穴效應,慢頻率下應用較長針刺時間可相對獲得更好效應;其內在作用機制可能是改善腦組織微循環狀態、調節缺血后炎癥反應,減輕神經細胞壞死。

[關鍵詞] 內關;針刺時間;效應;MCAO

Study on the Influence of Different Time for Intervention on MCAo Rats by Stimulating Neiguan Acupoint with Slow Frequency 

Sha YANG, Xiaonong FAN, Ding LUO, Ya’nan ZHANG, Yuanyuan WEI, Haitao ZHANG, Jianfei CHEN, Nina HE, Xiaobo CHANG, Shu WANG, Zhihong MENG, Xuemin SHI 

Abstract: Objective:Study on the influence of different time for Intervention on MCAo Rats by stimulating Neiguan acupoint with slow frequency.

Methods: The rats subjected to MCAo with suture method by Zea-Longa were divided into seven with randomization:normal group, sham operation group, model group, the non-acupuncture group, as well as stimulating Neiguan acupoint for a short time (5 seconds) group,stimulating Neiguan acupoint for a moderate time (60 seconds) group,stimulating Neiguan acupoint for a long time (180 seconds) group.The parameters of the three groups with simulation on Neiguan acupoint are fixed as 1 / s,and the frequency is respectively 5,60,180 seconds acupuncture time, and acupuncture once every 12 hours lasting for 6 times. Observe the effect indicators of the animal nerve function, microcirculation blood flow in the ischemia local , infarction rate of the brain tissue and mechanism indicators, including the microcirculation vascular input branches, diameter of the output branches, as well as morphological indicators of the brain tissue HE staining cells.As for the model group observe the effect indicators as soon as modeling successfully.as for the other four groups,observe the effect indicators 72 hours after modeling.Results: the effect indicators improvement of the three groups with simulation on Neiguan acupoint is better than the model group, the non-acupuncture group (P <0.05),as for the mechanism indicators the cortex, hippocampus, striatum microvessel counts the number of normal nerve cells (P <0.05) increase, the improvement of the indicators in the long time group is better. Conclusion: acupuncture on the Neiguan acupoint can get better effects, the acupuncture time can affect the Meridian effect,slow frequency with longer acupuncture time can  relatively  get better effect; its intrinsic mechanism may improve brain tissue microcirculation, regulation inflammation after ischemia , and relieve nerve cell necrosis.

Keywords:Neiguan; the acupuncture time; effect; MCAO 

      特定經穴效應的產生受患者的身體狀態、個體差異、針刺刺激強度等諸多種因素的影響。因此,會出現“疾病相同,但經穴效應不同”的情況,但是對于同一個病人,在已確定應用某種經穴“處方”的前提下,發揮經穴最大效應的直接手段,莫過于選擇“最佳”針刺方法(針刺手法、刺激參數、刺激量……),就如同中、西藥物劑量的調整。其中,針刺操作時間是最容易控制的[1]。為了研究針刺時間對經穴效應的影響及其內在機理,我們選取“醒腦開竅”針刺法主穴之一的內關穴,以1次/秒較慢頻率下分別施以代表短、中、長時間的5秒、60秒、180秒三種針刺持續時間的刺激,比較MCAO大鼠在神經功能缺損評分、腦血流、腦梗死面積比率及不同部位腦組織切片光鏡下細胞形態學指標上的差異。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

      1.1.1 主要試劑  水合氯醛(分析純);多聚甲醛(分析純);25%戊二醛;PBS溶液;TTC粉末;生理鹽水;蘇木伊紅(以上均由天津市瑞金特化學品有限公司提供);石蠟(上?;朗邢薰?、無水酒精(天津市化學試劑三廠)、二甲苯(天津市北方化學試劑廠)。甲醛溶液(分析純) (天津市化學試劑批發公司,天津市瑞科生物科技有限公司提供)。

      1.1.2 主要儀器  DRT4激光多普勒血流儀(英國Moor公司生產);XW-4彩色微循環檢測儀(合肥響石電子科技有限公司生產);LEICATP1200脫水機、LEICAEG1150H包埋機、LEICAEG1150C冰臺、LEICARM2245切片機(均由LEICA公司生產);TP-C攤片機、TP-C烘片機(均由久圣醫療公司生產);奧林巴斯光學顯微鏡;BencgMarkTM腦立體定位儀、STRONG 90牙科鉆、搖床、電子天平、Olympus fe-240數碼相機。

1.2 實驗動物與分組

       1.2.1 實驗動物  SPF級Wistar成年健康雄性大鼠,260g~280g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,合格證號:SCXK(京)2007-0001。

       1.2.2 實驗分組  以上大鼠共126只,隨機分為正常組、假手術組、模型對照組、非針刺組和內關組。內關組中又隨機分為短時間組、中時間組和長時間組,共有7組。

1.3 實驗方法

      1.3.1 模型制備  參照Zea-Longa線拴法[2]復制大腦中動脈缺血模型(MCAO),主要步驟:禁食水12小時,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350mg/kg)至動物對疼痛刺激反應消失為止,背位固定于大鼠手術板,局部消毒后備皮,取頸部正中稍偏左切口2~2.5 cm,分離二側甲狀腺,暴露左側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區,鈍性分離左側頸總動脈和頸外動脈,并用0號手術線結扎頸外動脈。在分叉處和近心端處分別用小動脈夾夾閉一段頸總動脈,然后用1ml注射器針頭在近心端處扎一個小孔,用0.260mm的魚線緩慢插入,待插進之后,放開分叉處的動脈夾,將魚線繼續進入頸內動脈,直至遇到阻力為止,魚線進入顱內深度為18-20mm,此時插入的魚線正好封閉大腦中動脈開口,阻斷大腦中動脈的血流。插線成功后結扎頸總動脈及針孔處,放開另一個動脈夾,清洗并分層縫合。

      1.3.2 造模成功判定  大鼠造模清醒后,按Zausinger六分法[3]對其神經功能進行評分,去除未造模成功及病情過輕過重的模型,即評分為0、4和5分的動物。

      1.3.3 針刺方法  (1)內關穴定位參照李忠仁《實驗針灸學》[4]:內關經穴于前肢內側離腕關節約3mm左右的尺橈骨縫間。造模成功后待大鼠清醒,約一個小時左右,即給予第一次針刺干預,固定針刺頻率為1 次/秒,短、中、長時間組刺激時間分別為5秒、60秒、180秒,之后每間隔12小時同樣方法干預一次,72小時共干預6次。(2)非針刺組:造模成功后在相應時間段內,用與針刺組實施同等條件的抓取,但不實施任何針刺干預,共抓取6次。(3)模型對照組:造模成功后,待大鼠完全清醒,不實施任何針刺,立即給予各項指標的測定。(4)正常組、假手術組:不實施造模手術及針刺干預,但也同等條件抓取,同樣抓取6次。

      1.3.4 觀察指標及方法  (1)神經功能缺損評分(即行為學評分):于造模成功時及72小時按Zausinger六分法進行評定。具體方法同前。(2)腦血流量和微循環管徑的測定:將大鼠麻醉后,以前囟為原點,移動立體定位儀,縱向向大鼠后方移動3mm,橫向向大鼠患側(即左側)移動1mm,在該點用激光多普勒儀測定數據,用鼠標選取平穩后1min的那段曲線,按軟件操作程序進行報告分析,最后導入到excel輸出保存。在測定腦血流量的點上用牙科鉆打一個直徑約5mm的孔,然后用XW-4彩色微循環檢測儀拍照,用軟件記錄和分析所得圖像數據。(3)腦組織梗死灶體積測定(TTC染色)方法:干預結束后,大鼠斷頭處死。2 min內取出大腦,用0℃生理鹽水沖洗并以濾紙吸干表面水分,于-20℃冰箱冷凍20min后取出,去除嗅球、腦干及小腦,放置到大鼠腦組織切片機,自前腦額極起,連續切出5片冠狀切片,片厚2 mm,將腦片置入1% TTC染色液中,37℃避光孵育30 min,中間一次翻面。用數碼相機攝下腦片,腦片兩面各拍攝兩張備用,后用計算機病理圖像分析系統,計算腦梗死面積百分比。(4)光鏡觀察腦組織HE染色切片計數微血管數、正常、壞死神經細胞數、炎性細胞數并計算神經細胞壞死率:將鼠腦取出后放置于12%的甲醛溶液中固定,選取額葉皮層、海馬、紋狀體三部位,改刀后分別放入PBS溶液中洗滌4次,置于脫水機中脫水24h;脫水后用石蠟包埋;切片機切片厚度5μm,在去離子水中攤片,再用干凈的載玻片撈起,二甲苯脫蠟、酒精水化后依次用蘇木精和伊紅染色最后用樹脂封片;用光鏡觀察,在400倍視野觀察計數微血管數、炎性細胞數、正常神經細胞數和壞死神經細胞數(神經細胞壞死率為壞死的神經細胞與正常神經細胞數比值)。各實驗組共有12張切片,即每組6只動物樣本,每樣本每個部位切片兩張,每張切片觀察兩個視野取其平均值記錄。

1.4 統計方法

      采用SPSS17.0軟件包,先進行數據正態性檢驗,若系正態分布則用單因素方差分析;如為偏態分布,選用秩和檢驗。運用單因素方差分析統計法。檢驗水準為α=0.05,若方差齊性檢驗,方差不齊時選用Dunnett T2檢驗進行兩兩比較,如果方差齊,則選用LSD檢驗。

2 結果

2.1 不同針刺時間對內關穴干預MCAO大鼠效應的影響

      見表1。在效應指標中,假手術組與正常組比較,神經功能缺損評分、腦血流量輕度下降,腦梗死率無增長,均無統計學差別(P>0.05),表明造模時手術操作對觀察指標未造成實質影響;模型組、非針刺組神經功能缺損評分、腦血流量明顯低于假手術組(P<0.05),腦梗死率明顯高于假手術組(P<0.05);而非針刺組則在神經功能缺損評分(P<0.05)、腦血流量結果高于模型組(P>0.05),腦梗死率低于模型組(P>0.05),說明腦梗死發生后鼠有向愈趨勢。在慢頻率下,內關各組的效應有隨針刺時間的延長而增效的表現:神經功能指標短、中、長時間下均有改善(與模型組比較P<0.05,但與非針刺組比較P>0.05),以中時間改善效應較好;腦血流量呈遞增趨勢(中、長時間組與模型組和非針刺組比較均P<0.05);對腦梗死率由大到小的時間順序依次為長-中-短(長時間組與模型組比較P<0.05),說明中、長時間刺激內關穴可增加腦血流量減小腦梗死率,有效改善神經功能缺損評分。

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2.2 不同針刺時間對內關穴干預MCAO大鼠效應影響的機制研究

(1)對微循環的影響(見表2)

      各組輸入支、輸出支管徑的變化趨勢一致。模型組大鼠微血管管徑較正常組、假手術組明顯收縮(P<0.05),非針刺組微循環管徑較模型組擴張明顯(P<0.05);相對于基礎組,內關穴各組均表現出“適度”而非一味地擴張微血管管徑,充分體現了經穴對機體機能的特異性調整作用。

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(2)對腦皮層的影響(見表3)

       結果顯示,MCAO模型大鼠皮層出現神經細胞壞死和炎性反應,經過72小時(非針刺組)皮層的神經細胞壞死未加重,而炎性反應明顯加強,對微循環的影響不大。針刺內關穴可抑制皮層神經細胞壞死,抑制或控制過度激烈的炎性反應(短時間組低于模型組,中、長時間組炎性細胞數低于非針刺組),明顯改善了微循環(微血管數增多)。

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      結果顯示,MCAO模型大鼠海馬出現微循環障礙、神經細胞壞死和炎性反應,經過72小時(非針刺組)海馬炎性反應進一步加強,而微循環明顯改善,神經細胞壞死得到遏制。短、長時間針刺內關穴均可改善微循環、抑制神經細胞壞死和炎性反應(短時間組改善微循環更顯著,長時間組抑制神經細胞壞死更明顯);中時間組可改善微循環,但炎性反應仍較強,神經細胞壞死無減輕(炎性細胞數和神經細胞壞死率均與非針刺組近似)。

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(4)對腦紋狀體的影響(見表5)

      結果顯示,MCAO模型大鼠紋狀體出現微循環障礙、神經細胞壞死和炎性反應,經過72小時(非針刺組)雖然紋狀體神經細胞壞死和炎性反應得到遏制,但微循環障礙進一步加重。針刺內關穴明顯改善紋狀體微循環(尤以短時間組明顯),抑制神經細胞壞死,但炎性反應進一步加強(中、長時間組)。


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       綜合以上三個部位研究結果,基礎組在皮層、海馬、紋狀體光鏡下形態學均表現出一致的趨勢:模型組與正常組、假手術組比較,神經細胞壞死率升高(P<0.05),微血管數減少,炎性細胞數增加;非針刺組與模型組比較,壞死率降低(P<0.05),微血管數減少(P<0.05),炎性細胞數減少。表明大腦中動脈梗死后,腦血流量減少,腦組織發生了微循環障礙、神經細胞壞死和炎性反應等廣泛的病理變化,從而影響神經功能;不予治療,72小時后,MCAO大鼠神經功能有所改善,提示生物具有自我修復能力,可能主要表現為遏制紋狀體炎性反應和海馬、紋狀體的神經細胞壞死,改善海馬微循環;另外,皮層、海馬的炎性反應加強、紋狀體微循環障礙加重可能是影響腦血流量和腦梗死面積改善、限制其修復能力的原因。

      內關穴增加微血管數、減少神經細胞死亡是對三個腦組織的共同作用。在皮層,內關長時間組各指標表現出了優于短、中時間的趨勢;在海馬部位,內關長時間組壞死神經元數減少,短時間組微血管數顯著增加);在紋狀體部位,內關長時間組正常神經元數最多,短時間下微血管數最多。

3 討論

      本研究探討針刺時間對經穴效應的影響,實際屬于針刺量效關系研究。該研究是針灸行業的基本問題之一,當是一系統研究工程,但總要從一穴、一個針刺參數變量開始。因此,我們選取了醒腦開竅針刺法的主穴之一內關為刺激點,從時間與頻率兩個可人為量化控制刺激量[5]的方面,模擬臨床慢頻率(1次/秒,即60次/分)下5秒、60秒、180秒三個針刺刺激時間為干預手段,探討特定經穴效應的針刺量學影響因素問題。

      在中醫理論中,內關為心包經絡穴,八脈交會穴之一,通陰維脈。心包經與心經相表里,代心受邪。心主血脈,主司周身的血液供應。醒腦開竅針刺法選擇內關為主穴之一,取其養心安神、疏通經絡、運行氣血之功。現代醫學證實,內關穴能特異性的降低心臟的耗氧量、減少腦梗死發生后引發的急性心肌,并增強泵血功能,提高腦的灌注量[6]。本研究結果顯示,三種針刺參數下,內關穴的效應均優于非針刺組,即針刺內關穴可提高神經功能評分,增加腦血流和降低梗死率,進一步證實針刺經穴改善疾病癥狀、減輕病理變化的有效性。同時顯示當應用較慢針刺頻率時,針刺內關穴有效性的強弱與針刺持續時間相關,表現為隨針刺時間的積累可獲得更好的治療效應。對腦組織的HE染色形態學觀察提示內關發揮治療效應的內在機理是改善不同部位微血管數量以改善血液供給[7,8,9],調整炎性反應,?;ふI窬赴?、降低神經細胞壞死率。這與針刺內關穴能抑制腦組織缺血半暗帶Caspase-3的表達,對抗半暗帶區細胞的凋亡、促進缺血局部腦組織血管新生有關[10]。生物體作為一個整體,在對來自于外界的刺激可作出一定的反應,而針刺刺激經穴可激發生物體一系列的集聯放大作用將機體的正向調節傳至全身,產生“小刺激大反應”[11],而且,本研究由于三種針刺時間干預內關穴均可產生類似效應和機制,從而證明內關穴存在經穴特異性。

      在本研究中,內關短、中、長針刺時間組之間效應不同,如內關中時間組改善改善神經功能缺損評分、減小腦梗死率的特異性比較顯著,而長時間組增加腦血流的特異性顯著,體現了經穴效應的相對性,即經穴效應可體現在多個方面[12],針刺時間是影響其發揮某種效應及產生效應大小的因素。同樣有其內在機制,短時間組改善海馬、紋狀體部位微循環作用明顯,長時間組抑制海馬神經細胞壞死、加強紋狀體炎性反應作用明顯;中時間組加強海馬、紋狀體炎性反應作用明顯。所以本研究結果可了解針刺時間對經穴效應的影響及其內在機制,但是換一角度,可以推論“獲得某種療效、改善某種機制可以用某種針刺時間”,也就是經穴效應的特異性與針刺刺激的參數相關,為了獲得不同的治療效應可以通過調節刺激參數來實現[13,14]。

      內關穴可以改善MCAO 大鼠神經功能,增加腦血流量減輕腦梗死面積,產生特異性效應,調節其梗死后局部腦組織微循環狀態,減低神經細胞壞死率,調整缺血后炎癥反應是內關穴特異性效應的內在作用機制;而且,針刺參數是影響經穴特異性的重要因素之一,在頻率較低時,延長針刺時間可以獲得較好的效應。

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